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　　美國E+E壓電生物傳感器臨床應用
　　壓電生物傳感器是一種將高靈敏的壓電傳感器與特異的生物反應結合在一起的新型生物分析方法 ,這一方法不需要任何標記 ,且儀器構造簡單、操作方便 ,引起人們的濃厚興趣 ,逐漸成為生物傳感器領域中的一項研究熱點。本文就壓電免疫傳感器及壓電基因傳感器在微生物、蛋白質及基因檢測等方面的研究應用作一綜述。壓電生物傳感器將在分子生物學、疾病診斷和治療、新藥開發、司法鑒定等領域具有很大開發潛力。

　　美國E+E壓電生物傳感器臨床應用
　　SNP （single nucleotide polymorphism,單核苷酸多態性）是指基因組特定位置上由單個核苷酸的變異所引起的一種DNA序列多態性，如果人群中這種變異的頻率大于1%,即稱為SNP。作為基因變異的主要形式，SNPs在對疾病的起因、風險評估和防治方面有著巨大的潛力。其研究已成為人類后基因組時代的主要內容之一。近年大量研究證實，SNP位點不僅與一些人類疾病直接相關、還可以用來預測個體對藥物治療的應答以及作為易患某種疾病的危險人群的標記，對疾病的風險評估和個性化醫療十分重要。因此，SNP的檢測技術對于臨床診斷醫學具有重要的潛在意義，有望為臨床疾病風險評估以及個性化醫療診斷的研究開辟新的切入點和研究焦點。 關于SNP的大量研究已經鑒定發現了很多和疾病相關的位點，但由于缺乏簡單有效快速低廉的臨床檢測手段，SNP的研究還停留在實驗室階段，SNP潛在應用價值遠遠沒有得到有效地挖掘。而壓電生物傳感器具有簡單實用快速低廉的特點，如能將其應用于SNP的檢測將具有廣闊的潛在臨床應用前景。但SNP只有一個堿基的差異，SNP的檢測需要檢測方法能從樣本中分辨出只有一個堿基差異的目的序列。靶序列和干擾序列之間僅有一個堿基的差異，質量變化小。這給基于質量效應原理的壓電生物檢測體系帶來挑戰，需要傳感器具有更高的敏感性和更好的特異性。因為本研究擬首先從多個方面提高壓電生物傳感器的穩定性，然后通過試驗證實生物素-鏈霉親和素放大系統可以放大壓電生物傳感器的信號，提高其檢測敏感性。在此基礎上，建立高敏感的壓電SNP檢測方法。同時利用EIS方法對壓電SNP檢測體系進行評估和驗證，并對實驗條件進行優化。zui后，以慢性乙肝易感相關SNP位點為靶點，初步研究壓電SNP檢測方法在臨床標本檢測中的應用情況。 二、方法和結果 1.利用酶生物信號放大系統建立高敏感的壓電傳感器SNP檢測方法： a.探討生物素-鏈霉親和素放大系統用來放大壓電生物傳感器的檢測信號的可行性研究：分別固定標記生物素和未標記生物素的探針于壓電傳感器基片上，然后加入結合HRP的鏈親和素以及DAB底物，檢測分析頻率變化。結果發現生物素將HRP-SA結合到基片上后，后者催化DAB形成的不可溶沉淀緊密附著于壓電基片表面，引發諧振頻率顯著改變，zui低可檢測ssDN段10-13mol/l,而對照則無法檢測出有意義的頻率變化。表明酶生物信號放大系統可以用于壓電傳感器，對發生在后者之上的生物反應信號進行放大，可以有效提高壓電傳感器的檢測敏感性。 b.利用酶生物信號放大系統，結合單堿基延伸技術，建立壓電生物傳感器的SNP檢測體系：分別合成兩條寡核苷酸，兩者間僅存在一個堿基的不同（A/G）；將其加入固定有未標記探針的壓電檢測池，分別利用Taq、Pfu以及Klenow fragment三種不同的DNA聚合酶將biotin-dUTP延伸結合到探針上；zui后加入DAB,檢測頻率變化。結果表明含A堿基的序列能引起頻率的顯著變化，約20倍高于含G堿基的序列；單堿基延伸所采用的三種聚合酶中，pfu的特異性和敏感性。在模式試驗中，本方法zui低可檢測出的zui低陽性靶序列的濃度為2×10-11mol/l。與檢測普通雜交信號比較，采用放大系統后，信號檢測時間可縮短至20min,且結果穩定性更好。 2. EIS系統的構建及其應用： 將壓電傳感單元、三電極系統和電化學工作站共同組成EIS檢測系統。設定適合分析壓電基片表面金膜的電化學參數，對空白時、探針固定后及雜交后金膜表面進行了交流阻抗譜的檢測，根據阻抗值分析金膜表面生物學反應情況。實驗發現少部分實驗用的壓電基片空白表面交流阻抗值異常，可影響實驗結果的重復性。探針固定和靶序列雜交的實驗條件為：針對實驗用的壓電基片金膜面積而言，zui適探針固定濃度為2μmol/l,zui適固定時間為60min,靶序列zui適雜交時間為60min。在壓電傳感器檢測SNP的每一步驟中，金膜表面交流阻抗值均有相應變化。 3.壓電SNP檢測方法的臨床應用： 首先以慢性乙肝持續感染相關SNP位點（ESR1 T392C）為靶點，分析并建立適合該位點的SNP檢測探針、引物以及標準檢測體系。然后收集的臨床標本，提取基因組DNA,并進行特異性的擴增。采用壓電SNP檢測方法對其進行檢測。結果表明該方法可以成功檢測出臨床來源標本中的ESR1 T392C位點。隨后以經典的RFLP方法為參照方法，以RFLP檢測的27例純合子為樣本，對比分析發現壓電SNP檢測方法TT型檢出率為94.7%,CC型檢出率為87.5%。兩種方法經x2檢驗，p0.05,表明我們建立的SNP壓電檢測方法在臨床標本的實際檢測中與RFLP相比具有較好的*性。 三、結論： 1.酶生物放大系統可以顯著增加壓電傳感器檢測DNA靶序列時的頻率變化，和干擾對照序列相比具有良好的特異性。表明酶生物放大系統有望作為一種特異、有效的放大手段應用于壓電生物傳感器，在檢測微小質量變化樣本中發揮重要作用。 2. EIS是一種有效的方法，可用來評價壓電生物傳感器，也可以用來優化其檢測條件，其建立的實驗條件符合壓電檢測實際情況，可用于壓電生物傳感器常規檢測的標準步驟和標準體系的建立。 3.建立了壓電SNP傳感器檢測慢性乙肝持續感染相關SNP位點（ESR1 T392C）的反應體系，初步研究了其頻率變化特點；通過臨床標本檢測，并和傳統方法RFLP對比分析，表明我們建立的SNP壓電檢測方法適合用于臨床標本的實際檢測。

　　美國E+E壓電生物傳感器臨床應用
　　近年來，壓電生物傳感器檢測技術逐漸成為生物分析中的研究熱點。它具有實時檢測、準確定量、特異性高、無需標記、經濟性等優點，被認為是現代臨床診斷發展的一個新方向。其原理在于壓電晶體表面負載的質量變化可通過自身諧振頻率變化反映出來，并通過固定不同識別元件，能夠檢測DNA、抗原-抗體、酶、細菌等多種物質，在分子識別、臨床診斷、分子成膜過程、表面性質、毒理研究等領域中已得到較為廣泛的應用。同時壓電生物傳感器操作簡便，環境要求簡單，檢測設備易于微型化使其具有更大的臨床應用價值。